식물의 DNA를 추출해보자.

처음 해보는 식물 DNA 추출 실험이었다.

 

Ⅰ. 실험 목표

 

DNA의 특성을 이해하고 브로콜리에서 DNA를 추출한다.

 

Ⅱ. 실험 기구 및 재료

 

브로콜리, 소금, 주방세제, 증류수, 에탄올, 0.5% 아세트산올세인 용액, 페놀-클로로포름 용액, microplate reader, 원심분리기, 전자저울, 1.5ml 튜브, 비커, 페트리 디쉬, 약종이, 약숟가락, 거즈, 핀셋, 피펫

 

Ⅲ. 실험 방법

 

1. 브로콜리에서 DNA 추출

 

1. 소금 2g, 세제 7g, 물 150ml를 섞어 소금-세제액을 만들어준다.
2. 브로콜리 50g을 막자사발 안에 넣고 가위로 잘게 자르고, 막자로 갈아준다.
3. 소금-세제액 100ml를 막자사발에 넣고 약 10분 동안 조심스럽게 섞으면서 갈아준다.
4. 거즈로 용액을 걸러낸다.
5. 유리막대로 세포추출액의 2배 만큼의 에탄올을 조금씩 흘려 넣는다.
6. 흰 색의 가는 선이 생기면 핀셋으로 휘감아 올린다.
7. 1.5ml tube에 증류수 1ml를 넣고 추출한 DNA를 녹인다.
8. 붓으로 이 용액의 일부를 묻힌 후 거름종이에 글씨를 쓰고 잘 말린 뒤 0.2% 아세트올세인 염색약에 15분 정도 넣어둔 후 열탕에서 5분간 아세트산올세인 용액을 제거한다. 유전물질을 색깔을 통해 확인한다.

 

2. 자외선 흡광도에 의한 DNA 농도 측정

실험을 통해 얻은 DNA 용액을 10배, 100배 희석한다.

희석한 DNA 용액을 수정 큐벳에 옮기고 260nm, 280nm의 흡광도 값을 각각 읽는다.

‘DNA 농도 = 260nm에서의 흡광도 값*50*희석배수’를 구한다.

260nm의 흡광도/280nm의 흡광도 값이 1.8보다 크면 순수한 DNA 용액이다.

 

3. DNA 용액에서 단백질 분리

실험을 통해 얻은 DNA 용액 1ml와 페놀-클로로포름 용액 1ml를 넣고 15분간 고속원심분리기로 원심분리한다.

 

Ⅳ. 주의사항

 

신선한 브로콜리를 사용하여 유전물질의 파괴를 막는다.

소금-세제액은 실험 직전에 만들어 사용한다.

세포 추출액에 에탄올을 천천히 넣어 긴 사슬의 DNA가 형성되도록 한다.

에탄올은 차갑게 하여 사용한다.

 

Ⅴ. 실험결과

 

260nm에서 흡광도의 평균값은 0.427

DNA 농도 = 0.427*50*10 = 213.5

단백질 제거를 하지 않았기 때문에 순수한 DNA 용액이 아니다.

 

Ⅵ. 실험 정리 및 논의

 

DNA 추출 과정에서 소금, 세제, 에탄올의 역할은 무엇일까?

먼저 소금은 DNA에 붙어있는 단백질을 분리시켜 순수한 DNA를 얻을 수 있게 한다. 또한 나트륨 이온은 DNA와 결합하여 응집을 촉진시킨다. 다음으로 세제는 DNA가 잘 추출되도록 세포막을 녹여준다. 물이 DNA에 녹기 때문에 녹지 않는 에탄올을 사용한다.

 

2. 에탄올을 처리하였을 때 추출되는 흰색 물질은 무엇인가?

추출되어 나트륨 이온과 결합하여 침전된 브로콜리의 단백질과 DNA이다.

 

3. 추출된 물질이 DNA가 맞는지 확인하는 방법에는 무엇이 있는가? 또한 그것의 원리는 무엇인가?

 

DNase 처리

DNase는 DNA 가수분해효소를 말하며 DNA에 특이적으로 작용하여 뉴클레오티드 사이의 결합을 가수분해시킨다.

 

염색

DNA는 (-)전하를 띠고 있어 아세트산 카민이나 메틸렌블루와 같은 (+)극을 띤 염색약으로 염색하여 확인할 수 있다.

 

전기영동법

EtBr은 두개의 염기가 결합한 DNA 사다리의 가로대와 비슷한 크기와 구조를

갖고 있어 DNA 염기쌍 사이로 잘 삽입된다. EtBr은 자외선을 받으면 가시광선으로 전환시켜 발광하는 성질을 갖는 일종의 형광물질이다. 추출된 DNA에 EtBr을 포함시켜 전기영동 시키면, DNA에 EtBr이 결합하게 되고 이를 자외선 하에서 관찰하면 발광하는 EtBr의 밝기로서 상대적인 DNA의 양을 측정할 수 있다.

 

자외선 흡광도에 의한 농도 측정

Spectrophotometer를 이용하여 약 260nm의 파장에서 흡광도를 측정하면 DNA의 농도를 알아낼 수 있다.

 

디페닐아민 분석법

디페닐아민으로 DNA를 정량하면 뉴클레오티드 중 퓨린계가 발색된다. 이러한 발색반응으로 흡광도를 구함으로써 DNA농도를 측정할 수 있는 것이다.