[생명과학 실험] DCPIP를 이용한 명반응 실험

생물 실험시간에 아주 유명한 DCPIP를 이용한 명반응 실험을 하게 되었습니다. DCPIP가 많이 환원될 수록 명반응이 많이 진행된 것이죠.

 

Ⅰ. 실험 주제

 

DCPIP를 이용한 조건에 따른 명반응의 활성을 측정한다.

 

Ⅱ. 실험 목표 :

 

광합성에 영향을 끼치는 요인을 찾아보고, 각 요인의 영향을 알아보는 실험을 설계한다. 실험과정을 Vee Diagram으로 나타내고 환경요인에 따른 광합성의 활성을 설명한다.

 

Ⅲ. 이론적 배경 :

 

1. 명반응

 

광합성 단계 중 빛이 관여하는 화학 반응으로, 엽록소에 의해 흡수된 빛에너지가 화학에너지로 전환되는 과정을 말한다.

 

2. DCPIP

 

2,6-dichlorophenolindophenol을 뜻하며 산화물의 한 종류이다. 따라서 DCPIP는 전자수용체 역할을 한다. DCPIP는 산화된 상태에서는 파란색을 띠지만 환원되면 색깔이 사라진다. 이를 이용하면 흡광도를 측정하여 환원정도를 측정할 수 있고, 따라서 명반응의 활성 정도도 측정할 수 있다.

 

Ⅳ. 실험 기구 및 재료 :

 

시금치, sucrose, DCPIP 용액, 증류수, microplate reader, 원심분리기, 광원, 항원수조, 시험관, 비커, 약종이, 약숟가락, 거즈

 

Ⅴ. 주의 사항 :

 

광원의 높이를 일정하게 유지한다.

거리는 광원 앞에서 시험관까지의 거리를 기준으로 한다.

광원의 불빛은 매우 밝으므로 눈으로 직접 쳐다보지 않는다.

온도를 통제할 때 투명 아크릴 수조를 사용하여 광원에서 나오는 열로 인해 물의 온도가 변하지 않도록 한다.

Pipeting 할 때는 기포가 생기지 않도록 유의한다.

 

Ⅵ. 실험 방법 :

 

1. 엽록체의 분리

냉장 보관한 시금치 잎 2~3장 정도를 큰 잎맥을 제거한 뒤 조직을 잘게 자른다.

차가운 0.5M sucrose 용액을 사용하여 마쇄한다.

잎 조직의 즙을 4겹의 거즈를 통하여 여과한 후 200xg로 3분간 원심분리 시킨다.

상등액을 다른 원심분리 튜브에 옮기고 1,000xg로 7분간 재차 원심분리하여 엽록체를 침전시킨다.

상등액을 제거하고 각 튜브에 차가운 0.5M sucrose 용액을 넣어 엽록체 현탁액을 제조한다.

 

2. 빛의 세기에 따른 명반응의 활성 측정

실험대 위에 광원을 고정시키고 자를 이용하여 광원으로부터 10cm, 20cm의 거리를 측정하여 표시한다.

광원 앞에 차가운 물을 채운 수조를 둔다.

시험관에 엽록체 현탁액, DCPIP 용액, 증류수를 넣는다.

측정한 위치에 시험관을 배치한다.

 

3. 온도에 따른 명반응의 활성 측정

증류수를 각각 냉장보관, 실온보관, 항온수조에 보관하여 온도를 달리한다.

실험대 위에 광원을 고정하고, 시험관 3개를 같은 위치(20cm)에 배치한다.

시험관을 labeling한 후에 각각의 시험관에 엽록체 현탁액, DCPIP 용액을 넣고 온도가 다른 증류수를 넣는다.

Micropipet reader를 이용하여 600nm에서 DCPIP가 환원되는 정도를 측정한다.

 

Ⅶ. 실험 결과 :

흡광도 시험관	0 min	10 min	20 min
10cm	0.329	0.162	0.146
20cm	0.327	0.220	0.180
30cm	0.320	0.154	0.136
얼음물	0.279	0.202	0.196
실온	0.296	0.194	0.178
뜨거운 물	0.258	0.250	0.258

 

 

 

Ⅷ. 실험 결론 :

 

1. 실험 결과 명반응이 일어나 DCPIP가 물에서 분해된 산소에 의해 산화되어 색이 점점 옅어져 흡광도가 작아졌다. 따라서 전체적으로 요인에 관계없이 시간이 흐를수록 흡광도는 감소했다. 즉, 물이 분해되는 과정인 힐 반응(물의 광분해) 과정이 일어났다고 할 수 있다.

 

2. 흡광광도법이란 빛이 시료 용액 중을 통과할 때 흡수나 산란 등에 의하여 강도가 변화하는 것을 이용하는 것으로서 시료물질의 용액 또는 여기에 적당한 시약을 넣어 발색시킨 용액의 흡광도를 측정하여 시료중의 목적성분을 정량하는 방법이다. 본 실험에서는 DCPIP의 흡광도를 측정하였다.

 

3. 명반응은 빛을 필요로 하는 반응이다. 전자전달계에서 빛 에너지를 받아 반응이 일어나기 때문이다. 실험 결과, 광원과의 거리가 10cm일 때 20cm보다 활성이 컸다. 그러나 예외적으로 거리가 30cm일 때는 가장 활성이 컸다. 이는 실험 중에 오차가 발생한 것으로 보이는데, 그 이유는 광원이 한 가지만 있었던 것이 아니기 때문이라고 생각된다.

 

4. 일반적으로 명반응은 온도의 영향을 크게 받지 않는 광화학적 반응이다. 실험결과에서 나타나듯이 얼음물과 실온에서의 활성은 크게 달라지지 않았다. 그러나 뜨거운 물에서는 급격히 명반응의 활성도가 감소되었다. 이는 높은 온도에서 효소의 변성작용이 일어났기 때문이라고 생각된다. 효소의 구조가 변형되면 제 기능이 상실되기 때문이다.